Isolering af klonen
Generelt udføres kloning for at opnå klonen af et bestemt gen eller en DNA-sekvens af interesse. Det næste trin efter kloning er derfor at finde og isolere den klon blandt andre medlemmer af biblioteket. Hvis biblioteket omfatter hele genomet af en organisme, vil et sted i biblioteket være den ønskede klon. Der er flere måder at finde det på, afhængigt af det pågældende specifikke gen. Oftest anvendes et klonet DNA-segment, der viser homologi med det søgte gen, som en sonde. For eksempel, hvis et musegen allerede er klonet, kan denne klon bruges til at finde den ækvivalente humane klon fra et humant genomisk bibliotek. Bakteriekolonier, der udgør et bibliotek, dyrkes i en samling af petriskåle. Derefter lægges en porøs membran over overfladen af hver plade, og celler klæber til membranen. Cellerne sprækkes, og DNA separeres i enkeltstrenge - alt sammen på membranen. Proben adskilles også i enkeltstrenge og mærkes, ofte med radioaktiv fosfor. Derefter anvendes en opløsning af den radioaktive sonde til at bade membranen. Den enkeltstrengede sonde-DNA klæber kun til DNA'et fra klonen, der indeholder det ækvivalente gen. Membranen tørres og placeres mod et ark med strålingsfølsom film, og et sted på filmene vises der en sort plet, der meddeler tilstedeværelsen og placeringen af den ønskede klon. Klonen kan derefter hentes fra de originale petriskåle.
genetik: Rekombinant DNA-teknologi og polymerasekædereaktionen
Tekniske fremskridt har spillet en vigtig rolle i udviklingen af genetisk forståelse. I 1970 amerikanske mikrobiologer Daniel Nathans
DNA-sekventering
Når et segment af DNA er blevet klonet, kan dets nukleotidsekvens bestemmes. Nukleotidsekvensen er det mest grundlæggende kendskabsniveau for et gen eller genom. Det er planen, der indeholder instruktionerne til opbygning af en organisme, og ingen forståelse af genetisk funktion eller evolution kunne være komplet uden at få disse oplysninger.
Anvendelser
Kendskab til sekvensen for et DNA-segment har mange anvendelser, og nogle eksempler følger. Først kan det bruges til at finde gener, DNA-segmenter, der koder for et specifikt protein eller fænotype. Hvis en region af DNA er blevet sekventeret, kan den screenes for karakteristiske træk ved gener. F.eks. Åbne læserammer (ORF'er) - lange sekvenser, der begynder med et startkodon (tre tilstødende nukleotider; sekvensen af et kodon dikterer aminosyreproduktion) og er uafbrudt af stopkodoner (undtagen et ved deres afslutning) - lægger vægt på protein-kodende region. Også humane gener er generelt støder op til såkaldte CpG-øer - klynger af cytosin og guanin, to af nukleotiderne, der udgør DNA. Hvis et kendt gen med en kendt fænotype (såsom et sygdomsgen hos mennesker) vides at være i den sekventerede kromosomregion, vil ikke-tildelte gener i regionen blive kandidater til den funktion. For det andet kan homologe DNA-sekvenser af forskellige organismer sammenlignes for at kortlægge evolutionære forhold både inden for og mellem arter. For det tredje kan en gensekvens screenes for funktionelle regioner. For at bestemme funktionen af et gen kan forskellige domæner identificeres, der er fælles for proteiner med lignende funktion. For eksempel findes visse aminosyresekvenser i et gen altid i proteiner, der spænder over en cellemembran; sådanne aminosyrestrækninger kaldes transmembrane domæner. Hvis der findes et transmembrane domæne i et gen med ukendt funktion, antyder det, at det kodede protein er lokaliseret i den cellulære membran. Andre domæner karakteriserer DNA-bindende proteiner. Flere offentlige databaser med DNA-sekvenser er tilgængelige til analyse af enhver interesseret person.
